Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về hoạt chất anthocyanin; các nghiên cứu này được tiến hành trên các loại nguyên liệu khác nhau như bắp cải tím, dâu tằm, hành tím, tỏi tía, hành lá, cần tây, cần ta, tía tô. Sử dụng anthocyanin làm các sản phẩm giấy kiểm tra pH. Anthocyanin được nghiên cứu tách chiết từ hoa bụp giấm cũng đã được ứng dụng làm chất chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm. Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã quan tâm đến việc tách chiết anthocyanin từ hoa đậu biếc và thử nghiệm một số hoạt tính sinh học, hoa đậu biếc khô thường được sử dụng để tách chiết anthocyanin trong nước hoặc ethanol với sự hỗ trợ của siêu âm.

Một số nghiên cứu cũng khảo sát các yếu tố tác động đến quá trình ly trích anthocyanin từ hoa đậu biếc như: nhiệt độ, tỷ lệ dung môi và thời gian. Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc ly trích anthocyanin để bổ sung vào thực phẩm hoặc ứng dụng làm các sản phẩm chỉ thị, nên đa số sử dụng ethanol làm dung môi chiết. Nghiên cứu tách chiết anthocyanin từ hoa đậu biếc tươi và các điều kiện ảnh hưởng đến độ bền màu đến nay vẫn chưa có nhiều. Đặc biệt, những khảo sát sơ bộ đã cho thấy hoa đậu biếc dạng kép có chứa hàm lượng anthocyanin cao hơn đáng kể so với hoa dạng đơn. Trên cơ sở đó, một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến việc tách chiết anthocyanin từ hoa đậu biếc tươi như thời điểm thu hái, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, pH dung dịch cũng được khảo sát. Dung dịch giàu anthocyanin chiết xuất theo quy trình thân thiện này được định hướng để sản xuất thành dạng bột hòa tan, sử dụng như một loại thức uống bổ sung hằng ngày, từ đó giúp nâng cao thu nhập cho người dân địa phương với loài cây hoang dại này.

1. Nguyên liệu

Hoa đậu biếc được sử dụng trong ngày. Hoa khô được thu nhận bằng cách sấy lạnh hoa tươi ở nhiệt độ 25⁰C, áp suất âm cho đến khi khối lượng mẫu còn lại 1/10 so với ban đầu. Độ ẩm hoa khô khoảng 8,5%.

2. Phương pháp tiến hành

2.1. Ảnh hưởng của thời gian thu hái và hình dạng hoa đậu biếc

Hoa đậu biếc tươi dạng đơn và dạng đôi thu hái trong các khoảng thời gian 6 giờ, 8 giờ và 14 giờ được sử dụng để đánh giá hàm lượng anthocyanin. Hoa được ngâm trong nước với tỷ lệ 10% (w/v) ở nhiệt độ 70⁰C trong 60 phút. Lọc và xác định hàm lượng anthocyanin trong dung dịch bằng phương pháp vi sai.

Phương pháp pH vi sai, dựa trên nguyên tắc chất màu anthocyanin thay đổi theo pH. Khi pH = 1, các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại. Khi pH = 4,5, anthocyanin ở dạng carbinol không màu. Phương pháp pH vi sai cho phép xác định hàm lượng anthocyanin tổng số chính xác và nhanh chóng, thậm chí khi có sự hiện diện của các hợp chất can thiệp khác. Mẫu được pha loãng trong hai dung dịch đệm: đệm kali clorua 0,025 M (pH 1,0) và đệm sodium acetate 0,4 M (pH 4,5). Tất cả các phép đo độ hấp thu bằng máy đo quang phổ được thực hiện ở bước sóng 520 nm và 700 nm.

Hàm lượng anthocyanin (theo cyanidin-3-glucoside) = (A × 449,2 × V × F)/ (ℇ × l)

Trong đó: A = (A520 nm - A700nm) pH 1 - (A520nm - A700nm) pH 4,5, 449,2 g/mol: Khối lượng phân tử cyanidin-3-glucoside, F: Hệ số pha loãng, V: Thể tích dịch chiết (lít), l: Bề dày cuvet (1 cm), ℇ = 26900: Hệ số hấp thụ phân tử.

2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu đến hàm lượng anthocyanin

Hoa đậu biếc tươi dạng đôi được ngâm trong nước ở nhiệt độ 70⁰C trong 60 phút. Tỷ lệ hoa sử dụng thay đổi ở các mốc 2,5%, 5%, 7,5% và 10% (w/v). Cùng với đó, hoa đậu biếc khô cũng được đánh giá ở các mốc 0,25%, 0,5%, 0,75% và 1%. Dịch lọc thu được từ các nghiệm thức được đánh giá hàm lượng anthocyanin để xác định tỷ lệ nguyên liệu phù hợp nhất. Hiệu suất ly trích anthocyanin được đánh giá theo công thức: H = tổng lượng anthocyanin/khối lượng khô hoa đậu biếc.

2.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng anthocyanin

Hoa đậu biếc tươi dạng đôi được ly trích anthocyanin trong nước ở nhiệt độ 70⁰C với tỷ lệ sử dụng 7,5%. Thời gian ly trích của các nghiệm thức thay đổi trong khoảng 20, 40, 60 và 80 phút. Dịch lọc thu được từ các nghiệm thức được đánh giá hàm lượng anthocyanin để xác định thời gian ly trích phù hợp nhất.

2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng anthocyanin

Hoa đậu biếc tươi dạng đôi được ly trích anthocyanin với tỷ lệ 7,5% ở 20 phút và 40 phút. Nhiệt độ ly trích giữa các nghiệm thức được thay đổi trong khoảng 40 đến 90⁰C, mỗi nghiệm thức cách nhau 10⁰C. Dịch lọc được thu và đánh giá hàm lượng anthocyanin để xác định nhiệt độ ly trích phù hợp nhất.  

2.5. Tối ưu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết anthocyanin từ hoa đậu biếc tươi

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp trực giao hai yếu tố theo mô hình CCF-design. Phần mềm Modde 5.0 được sử dụng để thiết kế và xử lý số liệu thực nghiệm. Ký hiệu các biến số, giá trị mã hóa và nội dung các nghiệm thức.

Mô hình phương trình hồi quy đa thức bậc 2 được lựa chọn để mô tả ảnh hưởng của các nhân tố lựa chọn đến hàm lượng anthocyanin (mg/L):

Y = a₀ + a₁X₁ + a₂X₂ + a₁₂X₁X₂ + a₁₁X₁₂ + a₂₂X₂₂

Với: X₁, X₂ là các biến độc lập; a₀ là hệ số phương trình hồi quy; a₁₂ là hệ số tương tác; a₁₁, a₂₂ là hệ số bậc 2; Y là hàm lượng anthocyanin

2.6. Ảnh hưởng của pH dung dịch ly trích đến hàm lượng anthocyanin

Hoa đậu biếc tươi được ngâm trong nước với liều lượng 7,5% (w/v) ở nhiệt độ 70⁰C trong thời gian 20 phút. pH của dung dịch ly trích được điều chỉnh bằng acid citric 0,1% hoặc NaHCO₃ 0,1% để đạt được các giá trị: 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 và 8,0. Hàm lượng anthocyanin được xác định bằng phương pháp vi sai để đánh giá ảnh hưởng của pH.

3. Xử lý thống kê

Đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa bằng phương pháp Anova với độ tin cậy 95% sử dụng phần mềm Stargraphics Centurion XV; sử dụng phần mềm Modde 5.0 để bố trí mà trận tối ưu và xử lý kết quả.

4. Kết luận

Hoa đậu biếc tươi dạng đôi được thu hái vào khoảng 6 giờ sáng cho hiệu quả ly trích anthocyanin tốt nhất. Nhiệt độ và thời gian ly trích có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng anthocyanin. Ở tỷ lệ nguyên liệu 7,5%, dịch chiết có hàm lượng anthocyanin cao nhất khi ly trích với nước ở nhiệt độ 69,9⁰C trong thời gian 20 phút. pH cũng có ảnh hưởng đến quá trình ly trích, hàm lượng anthocyanin cao nhất khi ly trích pH từ 5,0 đến 7,0. Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc sử dụng hoa đậu biếc như một nguồn anthocyanin, giúp đem lại nguồn thu nhập tăng thêm cho người dân địa phương và hình thành nên các vùng trồng hoa đậu biếc làm nguyên liệu cho các cơ sở chế biến sâu.