Với khoảng 1.000 loài hại thực vật được phát hiện và hơn 650 loài đã được nghiên cứu, virus là một trong những tác nhân gây bệnh chính làm giảm sản lượng cây trồng trong sản xuất nông nghiệp. Đặc biệt, các virus thường có phổ kí chủ rộng, lan truyền theo nhiều con đường và không thể phòng trừ bằng thuốc nên khi bùng phát thành dịch, bệnh virus thường để lại tổn thất lớn về kinh tế cho người sản xuất. Vì vậy, chọn tạo giống kháng bệnh là một biện pháp hiệu quả giúp giảm thiểu tác hại của bệnh virus trên các loại cây trồng, trong đó có cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.). Là cây kí chủ của hơn 20 loài virus khác nhau, cho nên, thuốc lá là một trong những đối tượng xuất hiện nhiều nhất trong các nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen kháng virus.

Với sự phát triển mạnh của công nghệ sinh học, trong hai thập kỉ gần đây, hiện tượng bất hoạt gen theo cơ chế RNAi (RNA interference) đã trở thành một công cụ hiện đại và được ứng dụng phổ biến trong tạo giống cây trồng kháng virus. Cho đến nay, trên thế giới, đã có nhiều loại cây trồng kháng virus được tạo thành công dựa trên công nghệ RNAi, trong đó có nhóm cây kháng được một loại virus như: lúa, khoai tây, cà chua…và nhóm cây kháng đồng thời với nhiều loại virus khác nhau như: đậu tươn, dưa hấu... Trong nghiên cứu trước của chúng tôi, cơ chế RNAi cũng được ứng dụng trong tạo các dòng thuốc lá T0 chuyển gen kháng virus khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus-TMV) và kháng virus phổ rộng (gồm 4 loại virus là TMV, CMVCucumber mosaic virus, TYLCV-Tomato yellow leaf curl virus và TSWV-Tomato spotted wilt virus). Kết quả đánh giá tính kháng sơ bộ cho thấy, tỷ lệ kháng TMV thu được ở 2 giống K326 và C9-1 lần lượt là 64,3% và 58,3%, tỷ lệ kháng virus phổ rộng là 30,3%. Để tiếp tục theo dõi và đánh giá khả năng kháng virus của các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ tiếp theo, trong nghiên cứu này, hạt T1 thu từ cây thuốc lá chuyển gen T0 được sử dụng làm vật liệu. Mức độ hoạt động của cấu trúc chuyển gen được xác định thông qua thí nghiệm đánh giá sự phân li, sự di truyền và biểu hiện tính kháng ở mức độ phân tử của gen chuyển và thí nghiệm lây nhiễm virus.

Hạt thuốc lá T1 thu từ các dòng thuốc lá chuyển gen T0 mang cấu trúc RNAi TMV và RNAi TCYS có khả năng kháng hoàn toàn với virus. Trong đó, cấu trúc RNAi TMV là vector chứa đoạn gen CP (313 bp) mã hóa cho protein vỏ của TMV được thiết kế lặp lại đảo chiều, xen giữa là 1 trình tự intron; RNAi TCYS là vector chuyển gen được thiết kế tương tự, đoạn gen TCYS (1.000 bp) được tạo thành từ sự ghép nối các đoạn gen chức năng của 4 virus gồm: 3 đoạn gen CP của 3 virus TMV, CMV, TSWVvà 1 đoạn gen đa đoạn của TYLCV (đoạn gen CP, C1/C2, C1/C4 và βC1). Các vector chuyển gen chứa gen chọn lọc manA thay thế gen chọn lọc kháng kháng sinh, cho phép sử dụng đường mannose làm chất chọn lọc. Sử dụng các phương pháp nghiên cứu: phương pháp phân tích sự phân li của gen chuyển, phương pháp PCR và lai Southern blot, phương pháp lai Northern blot, phương pháp đánh giá tính kháng virus.

Kết quả phân tích phân tử và đánh giá tính kháng virus cho thấy, đã có 10 dòng thuốc lá mang cấu trúc RNAi TMV và 6 dòng mang cấu trúc RNAi TCYS có tỷ lệ phân li gen chuyển là 3:1. Thí nghiệm đánh giá tính kháng virus của các dòng chuyển gen này thu được kết quả là: tỷ lệ kháng hoàn toàn với TMV ở 10 dòng thuốc lá mang cấu trúc RNAi TMV là 5-20%; tỷ lệ kháng hoàn toàn với 4 virus TMV, CMV, TYLCV, TSWV của 3 dòng thuốc lá mang cấu trúc RNAi TCYS (TCYS-K07, TCYS-K18 và TCYS-C17) là 5% và tỷ lệ này là 0% ở 3 dòng TCYS-K06, TCYS-K20 và TCYS-C12. Kết quả này chứng tỏ, gen chuyển tiếp tục được di truyền và biểu hiện ở các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1.