Hiện nay, có nhiều phương pháp giảm thiểu khí methane như: phương pháp vật lí, hóa học như hấp thụ bằng cacbon hoạt tính hoặc đốt, tuy nhiên các phương pháp này có hiệu quả không cao và đòi hỏi chi phí cao. Trong khi đó, phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học là một phương pháp có thể thay thế cho các phương pháp vật lí, hóa học vừa thân thiện với môi trường vừa tiết kiệm chi phí, dựa trên hoạt động của các vi khuẩn có khả năng oxy hóa methane (MOB). Các chủng vi sinh vật có hoạt tính oxy hóa khí methane có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm vi sinh cho nông nghiệp trồng trọt, chăn nuôi, góp phần làm giảm lượng phát thải khí nhà kính.

Methanotrophs là nhóm vi khuẩn Gram âm sử dụng khí methane làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất, do đó làm giảm lượng khí phát thải ra môi trường và góp phần giảm thiểu sự nóng lên toàn cầu. Các vi khuẩn Methanotrophs cũng được báo cáo sinh sống ở ruộng lúa, hồ, đất ngập nước, hồ nước ngọt, đống ủ compost, đầm lầy than bùn, suối nước nóng và trầm tích biển. Vi khuẩn oxy hóa methane (MOB) là nhóm vi sinh vật duy nhất sử dụng methane như nguồn năng lượng và cacbon để sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí bao gồm một số chi như: Methylosphaera, Methylobacter, Methylomicrobium, Methylomonas, Methylococcus, Methylosinus, …

Đây là nhóm tham gia chủ yếu vào chu trình chuyển hóa methane trong tự nhiên, do đó vi khuẩn oxy hóa methane đóng góp quan trọng trong kiểm soát phát thải methane toàn cầu. Methane Oxidizing Bacteria (MOB) là một tập hợp con của methylotrophs và có khả năng sử dụng methane làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Methanotrophs oxy hóa CH₄ thông qua enzyme methane monooxygenase (MMO) tồn tại dưới dạng chất hòa tan (sMMO) và dạng hạt (pMMO), cả hai đều oxy hóa methane (MOBs) chuyển hóa methane thành sinh khối tế bào và CO₂, trong đó methanol là một chất trung gian. Trong các sinh vật có cả enzyme sMMO và pMMO; khi nồng độ đồng quá cao sẽ làm chậm quá trình chuyển hóa methane nhờ enzyme sMMO của vi khuẩn và gây nên sự biểu hiện của pMMO gắn với màng intracytoplasmic; ngược lại khi nồng độ đồng thấp sẽ thúc đẩy quá trình chuyển hóa methane nhờ enzyme sMMO, biểu hiện và liên kết với methanobactins. Stępniewska, Goraj, Kuźniar, Łopacka1, và Małysza đã phân lập được các chủng vi khuẩn Methylomonas sp. từ một số thực vật ở khu vực Hồ Moszne nằm ở phía tây bắc của Vườn Quốc gia Poleski, Ba Lan có khả năng oxy hóa CH4 từ 0.463 ± 0.067 đến 5.928 ± 0.169 μmol/L CH₄/ml/ngày, tương đương giảm 70% CH₄ sau 06 ngày nuôi ủ. Theo nghiên cứu Adriany, Santoso1, Akhdiya, và Wihardjaka đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn MOB từ 03 canh tác lúa khác nhau, trong đó khả năng oxy hóa methane cao nhất là 23% sau 15 ngày ủ. Việc phân lập được chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa khí methane nhằm nghiên cứu ứng dụng để tạo nguồn đạm vi sinh. Nhóm tác giả nhận thấy rằng khi sinh trưởng với methane và oxy, chủng vi khuẩn này đã sản sinh ra lượng sinh khối có hàm lượng protein thô cao (68.69%) với hiệu suất chuyển hóa methane là 2,805 m3/kg sinh khối khô.

Ở nghiên cứu này, từ các mẫu đất bùn, đất trồng lúa, nước thải biogas, mẫu dạ cỏ và mẫu nước sông, tiến hành phân lập và sàng lọc vi khuẩn có khả năng oxy hóa khí methane nhằm xây dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn có hoạt tính mong muốn, làm tiền đề nghiên cứu chế phẩm vi sinh giúp giảm phát thải khí CH₄ trong trong chăn nuôi gia súc hay quá trình canh tác lúa ở Việt Nam.

1. Vật liệu

Thu nhận 56 mẫu bao gồm: 13 mẫu đất bùn (ở Tây Ninh, Kiên Giang, Đà Lạt), 32 mẫu đất trồng lúa (ở Tây Ninh, Kiên Giang, Vĩnh Long, Đà Lạt), 04 mẫu nước thải biogas (ở Thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương, Vĩnh Long), 03 mẫu dạ cỏ (ở Tân Biên, Tây Ninh) và 04 mẫu nước sông (ở Thủ Đức, Bình Dương). Đối với mẫu đất được lấy sâu xuống dưới và cách mặt đất khoảng 20cm. Đối với mẫu nước được lấy và đựng bằng túi zipper hoặc hủ nhựa vô trùng có nắp.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng oxy hóa khí methane

Môi trường phân lập và giữ giống vi khuẩn có khả năng oxy hóa khí methane là môi trường dAMS. Môi trường dAMS bao gồm: Salt stock 20mL, FeNaEDTA Stock 1mL, Na₂HPO₄.12H₂O Stock 10mL, Trace solution 1mL, nước cất 968mL; trong đó Salt stock gồm: MgSO₄.7H₂O 10g/L, NH₄Cl 5g/L, CaCl₂.2H₂O 1.5g/L; FeNaEDTA 0.5g/100mL; Na₂HPO₄.12H₂O 71.7g/L; Trace solution gồm: Na₂EDTA.2H₂O 0.5g/L, FeSO₄.7H₂O 0.2g/L, H₃BO₃ 0.03g/L, CoCl₂.6H₂O 0.02g/L, ZnSO₄.7H₂O 0.01g/L, MnCl₂.4H₂O 0.003g/L, NaMoO₄.2H₂O 0.003g/L, NiCl₂.6H₂O 0.002g/L, CuSO₄ 2.5g/L.

Đối với mẫu đất, đất bùn, dạ cỏ: Cân 3g mẫu cho vào bình serum chứa 10ml môi trường dAMS, đậy kín bằng nút cao su silicon. Hút khí trong bình ra bằng kim tiêm và bơm CH₄ qua màng lọc 0.2μm vào bình, tỉ lệ CH₄ với không khí bình là 50:50 hoặc 70:30, nuôi ủ lắc ở 30⁰C từ 03 đến 07 ngày.

Đối với mẫu nước sông, nước thải biogas: Hút 3ml mẫu cho vào bình serum chứa 10ml môi trường dAMS có bổ sung khí CH4 tương tự như đối với mẫu đất bùn, tiến hành nuôi ủ lắc ở 30ºC từ 03 đến 05 ngày.

Sau 03 - 05 ngày nuôi ủ, tiến hành hút 05 - 10ml dịch nuôi vào bình chứa 45ml môi trường dAMS có bổ sung tỉ lệ khí CH₄ trong bình 30 - 50%, 03 - 05 ngày lặp lại một lần. Sau khoảng 25 ngày nuôi ủ, pha loãng dịch nuôi đến độ pha loãng đến nồng độ pha loãng 10-5. Tiến hành cấy trải 100μL dịch ở các nồng độ pha loãng lên môi trường dAMS agar, nuôi ủ ở 30ºC trong hộp kín có bổ sung 30 - 50% khí CH₄. Khi xuất hiện các khuẩn lạc mọc trên môi trường, tiếp tục cấy phân lập sang môi trường dAMS agar.

2.2. Định lượng khả năng làm khí methane của các vi khuẩn oxy hóa methane

Vi khuẩn oxy hóa khí methane đã phân lập được nuôi trong bình có nắp cao su và kẹp nhôm chứa 100ml dAMS và 50 - 70% khí CH₄. Đậy kín nắp lọ, ủ 30°C, nuôi lắc 200 vòng/phút.

Sau khi bổ sung khí CH₄, tiến hành lấy mẫu khí gửi đi phân tích lần 01 tại Viện Công nghệ Hóa học. Mẫu khí được phân tích bằng phương pháp sắc kí khí GC, đầu dò FID và sau khi phân tích lần 01, tiến hành bổ sung 5 - 10ml vi khuẩn. Hỗn hợp phản ứng được phân tích trên máy phân tích sắc ký khí Agilent Technologies 6890 Plus, máy được trang bị phần mềm GC Chem Station để xử lý số liệu, tại Viện Công nghệ Hóa học. Phân tích CH₄ sử dụng detector ion hóa ngọn lửa FID và cột mao quản DB-624 (chiều dài 30m, đường kính trong của cột 250μm, độ dày lớp phim 0.32μm) với chế độ hoạt động: Nhiệt độ lò 60⁰C; Áp suất 20.0 PSI; Tỉ lệ chia dòng 25/1; Nhiệt độ buồng tiêm 250⁰C; Nhiệt độ đầu dò 250⁰C; và khí mang N2. Thể tích mẫu bơm phân tích: 0.2mL.

Sau 07 ngày nuôi ủ, tiếp tục lấy mẫu khí gửi đi phân tích lần 02 để xác định % CH₄ giảm.

3. Kết luận

Từ các mẫu đất bùn, đất trồng lúa, nước thải biogas, dạ cỏ và nước sông, nhóm nghiên cứu này đã phân lập được 370 chủng vi khuẩn tiềm năng trên môi trường dAMS với CH₄ là nguồn carbon duy nhất. Kết quả xác định khả năng làm giảm CH₄ của 18 chủng vi khuẩn ngẫu nhiên đại diện các nguồn mẫu cho thấy đều có khả năng oxy hóa methane, trong đó hai chủng TB18 và DC11 được phân lập từ đất trồng lúa và dạ cỏ có khả năng oxy hóa methane cao nhất. Kết quả của nghiên cứu này giúp xây dựng đa dạng bộ sưu tâp các chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa methan, làm tiền đề nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh giúp giảm phát thải khí CH₄ trong chăn nuôi gia súc, quá trình canh tác lúa hay các nhà máy xử lý rác ở Việt Nam.