Các thành phần trong bột rễ, thân, lá cây quýt gai

Cây quýt gai còn được gọi là tầm xoọng, gai xanh, độc lực, mền tên, cúc keo, quýt hôi, quýt rừng, cây gai xanh, tửu bính lặc, cam trời, có tên khoa học là Atalantia buxifolia (Poir.) Oliv. thuộc họ Cam (Rutaceae). Cây phân bố ở Hà Nội, Ninh Bình và ven biển Trung Bộ. Trên thế giới, cây quýt gai còn được phân bố ở các nước trên thế giới như: Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Malaysia, Philipin. Ở Việt Nam, cây được dùng trị cúm, cảm mạo, đau đầu, ho, viêm phế quản, sốt rét; đau dạ dày, viêm khớp xương do phong thấp, đau lưng gối; rễ được sắc hoặc ngâm rượu chữa tê thấp, trị rắn cắn; quả xanh chữa ho (Vo, 2018). Ở Trung Quốc, loài này cũng được dùng tương tự, để chữa ho, sốt rét và thấp khớp. Các loài trong chi Atalantia đã được nghiên cứu và cho thấy có các tác dụng dược lý như chống dị ứng, kháng khuẩn, chống ăn mòn, gây độc tế bào, có tác dụng long đờm và chống sốt rét (Chang et al., 2018). Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các tác dụng như chống oxy hóa, kháng viêm, chống côn trùng, cải thiện tình trạng viêm phổi mạn tính và các thành phần hóa học bao gồm alkaloid, triterpenoid, tinh dầu của loài này (Yang et al., 2013; Yin, 2014; Chang et al., 2018; Truong et al., 2019; Liang et al., 2020; Bui et al., 2022). Tuy nhiên, chưa có công bố về đặc điểm hình thái và vi học của loài cây này. Do vậy, đặc điểm hình thái và vi học của mẫu cây quýt gai được thu hái ở huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế đã được nghiên cứu nhằm xác định tên khoa học của loài và cung cấp cơ sở dữ liệu về thực vật học để giúp nhận diện, kiểm nghiệm dược liệu của loài này.

Đối tượng nghiên cứu là Mẫu cây quýt gai được thu hái ở huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 7/2022 và được lưu tại Bộ môn Thực vật - Khoa Dược , Trường Đại học Lạc Hồng.

Các phương pháp dung trong nghiên cứu bao gồm:

- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật học:

+  Đặc điểm hình thái: Đặc điểm hình thái được quan sát bằng mắt thường, kính hiển vi quang học (Olympus CX23 LED) và kính soi nổi Olympus SZ51, chụp hình, mô tả các đặc điểm khảo sát. Tên khoa học của loài được xác định bằng cách đối chiếu với các tài liệu tham khảo (Pham, 1999; Vo, 2018).

+  Đặc điểm giải phẫu: Cây được cắt ngang rễ, thân, gai, lá, cuống lá thành lát mỏng bằng dao lam; với thân cây, cắt ở phần lóng không sát mấu; với phiến lá và cuống lá, cắt ở khoảng 1/3 phía dưới của phiến và cuống nhưng không sát đáy. Vi phẫu được tẩy trắng với Javel và nhuộm bằng thuốc nhuộm son phèn và lục iod (carmin vert de mirande). Vi phẫu được quan sát trong nước dưới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và mô tả cấu trúc. Mỗi bộ phận quan sát từ 5 đến 10 vi phẫu.

      + Đặc điểm bột dược liệu:Thân và lá được cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ 50-60oC đến khô, nghiền và cho qua rây số 32 (đường kính mắt rây 0,1 mm). Các thành phần của bột (phân tán trong nước cất) được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Mô tả và chụp ảnh các cấu tử.

-    Phương pháp phân tích ADN

+   Hóa chất: (1) Hóa chất ly trích ADN: CTAB Buffer (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8,0, 20 mM EDTA pH 8,0, 1,4 M NaCl), β-mercaptoethanol, chloroform:isoamyl alcohol (24:1), enzyme RNase, isopropanol, ethanol (70%).  (2) Hóa chất PCR và điện di: PCR Mix (NEXpro, Korea), agarose tinh khiết, thuốc nhuộm ethidium bromide, TAE 1X, giấy parafilm, loading dye 6x, ladder 1 kb plus, TE, nước tinh sạch (nước cất 2 lần và đã qua thanh trùng ở 121oC trong 20 phút).

+   Phương pháp ly trích ADN :Đầu tiên, 100 mg mẫu được nghiền mịn với 1 ml dung dịch CTAB 2X (đã ủ ở 65 oC trong 15 phút); thêm vào từng tuýp 10 µl β-mercaptoethanol, ủ ở nhiệt độ 65oC trong 60 phút (lắc trộn mỗi 10 phút). Tiếp tục, 500 µl chloroform được thêm vào, ly tâm 13000 vòng/10 phút; rút 750 µl dung dịch bên trên qua tuýp mới, thêm 500 µl chloroform, ly tâm 13000 vòng/10 phút (lặp lại bước này 2 lần); rút 400 µl dung dịch bên trên vào tuýp mới, thêm 400 µl isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn đều và ủ lạnh ở -20oC/30 phút, sau đó ly tâm, bỏ phần dung dịch, giữ tủa lắng bên dưới. Sau đó, 500 µl ethanol 70% được thêm vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng/5 phút để rửa sạch mẫu, loại phần dịch chừa lại kết tủa; lặp lại 2 lần rồi đem mẫu đi phơi khô 1 giờ; thêm vào mỗi tuýp 30 µl TE (pH = 8,0) để hòa tan ADN và trữ lạnh ở -20oC (Doyle, 1990).

+  Kiểm tra ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose: Đầu tiên, 0,25 g agarose được đun sôi với 25 ml dung dịch TAE 1X rồi đổ vào khuôn điện di; sau 30 phút, tháo lược và cho gel vào dung dịch TAE 1X trong bộ điện di sao cho gel ngập trong phần dung dịch; trộn đều mỗi mẫu với 1 µl loading dye 6X, 1 µl ADN và 4 µl nước PCR trên giấy parafilm rồi cẩn thận bơm từng mẫu vào giếng trên gel; đậy nắp bộ điện di lại và bắt đầu chạy điện di mẫu ở 85V trong 30 phút. Sau đó, mẫu được đem nhuộm trong ethidium bromid (10 mg/lít) khoảng 10 phút; kế tiếp đem rửa trong nước cất trong 5 phút và đem chụp ảnh gel với máy đọc gel bằng tia UV (Doyle, 1990).

+   Phản ứng PCR:Phản ứng khuếch đại  ADN gồm 50 µl, sử dụng bộ PCR KIT (NEXproTM Diagnostics) gồm các thành phần 10X e-Taq Buffer, 10 mM dNTP, e-Taq ADN Polymerase, thêm vào nước tinh sạch, cặp mồi RBCL và ADN. Mẫu được trộn đều rồi cho vào máy PCR GeneAmp PCR System 2700. Phản ứng này được thực hiện trong 35 chu kỳ gia nhiệt, bao gồm: 5 phút ở 95^oC, 30 giây ở 95_oC, 30 giây ở 60^oC, 30 giây ở 72^oC; kéo dài chuỗi trong 5 phút ở 72oC và sản phẩm được trữ ở 10oC trong 20 phút (Doyle, 1990). PRISMTM 3130XL ADN Genetic Analyzer (Sanger, 1977).  

+   Phân tích số liệu: Trọng lượng phân tử được tính toán bằng phần mềm GelAnalyzer. Kết quả giải trình tự được lưu trữ ở dạng FASTA và phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản cập nhật mới nhất 7.0.5. Sau đó, phương pháp BLAST trên hệ thống ngân hàng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information) được sử dụng để nhận diện loài.

-    Phương pháp định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật: Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của mẫu bột dược liệu theo quy trình phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Bucarest Rumani) được cải tiến bởi Khoa Dược – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Bột thân (10 g), bột lá (10 g) được chiết xuất lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (diethyl ether, cồn, nước) và thu được các dịch chiết tương ứng. Các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết được xác định bằng các phản ứng hóa học đặc trưng (Deparment of Pharmacognosy, 2016).

 Qua thời gian nghiên cứu, kết quả cho thấy đặc điểm hình thái, giải phẫu và bột của rễ, thân, lá của cây quýt gai được mô tả chi tiết trong nghiên cứu để cung cấp dữ liệu cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cây thuốc. Đồng thời, việc đối chiếu với dữ liệu ADN của ngân hàng gen khẳng định đây chính là loài Atalantia buxifolia (Poir.) Oliv. Về mặt hóa học, thân và lá loài này có chứa các nhóm hợp chất tinh dầu, triterpenoid tự do, alkaloid, coumarin, polyphenol, saponin, triterpenoid thủy phân, acid hữu cơ và chất khử.