Người chăn nuôi là đối tượng bị ảnh hưởng trực tiếp và nó cũng gây ảnh hưởng gián tiếp đến các giai đoạn trong chuỗi cung ứng thịt lợn. Trong khi đó, bệnh dịch tả lợn cổ điển  (Classical  swine  fever-  CSF) là một bệnh truyền nhiễm phổ biến ở lợn, lây lan nhanh, do virus giống Pestivirus thuộc họ Flaviviridae, gây ra. Đây là virus ARN chuỗi đơn sợi dương, có độ dài 12 Kb mã hóa cho 4 protein cấu trúc và protein phi  ấu trúc. Bệnh dịch tả lợn cổ điển xảy ra trên lợn gây thiệt hại trầm trọng về mặt kinh tế cho người chăn nuôi. Khi dịch bệnh xảy ra việc xác định nhanh, chính xác căn nguyên và điều tra các yếu tố nguy cơ dịch tễ để hạn chế sự lây lan, giảm thiệt hại về kinh tế là điều quan trọng. Việc chẩn đoán phân biệt trong thực địa là rất khó khăn, bởi vì hai bệnh ASF và CSF có nhiều điểm tương đồng về biểu hiện lâm sàng. Khi bệnh xảy ra ở thể quá cấp và cấp tính các biểu hiện đặc trưng chưa xuất hiện thì việc chẩn đoán trong  phòng  thí  nghiệm  là  phương  pháp chẩn đoán thường được lựa chọn. Một kết quả tối ưu nhất là khi kết hợp kết quả từ phòng thí nghiệm và dữ liệu từ những yếu tố dịch tễ liên quan. Hiện nay, một số phương pháp thường được sử dụng để phát hiện virus gồm phân lập virus, miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct fluorescent antibody test-DIFT), PCR và Real-time  PCR, mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng. Phương pháp Realtime PCR là phương pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, xét nghiệm được trên nhiều nền mẫu lâm sàng khác nhau. Đây là các phương pháp đang được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam để chẩn đoán bệnh ASF và CSF. Tuy nhiên, hiện nay các quy trình xét nghiệm thường chỉ xét nghiệm riêng lẻ từng bệnh điều này dẫn tới tốn kém về mặt thời gian, nguyên liệu, hóa chất… Phương pháp multiplex  Real-time  RT-PCR  đã  được nghiên cứu phát triển trước đây và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới.

Ở Việt Nam, phương pháp này cũng đã được áp dụng để phát hiện  nhiều tác nhân khác nhau. Tuy nhiên, việc việc nghiên cứu áp dụng phương pháp này trong các phòng thí nghiệm để xét nghiệm đồng thời hai bệnh trên còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu  này được thực hiện nhằm mục tiêu tối ưu hóa phương pháp multiplex Real-time RT-PCR để phát hiện đồng thời virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi và virus gây bệnh dịch tả lợn cổ điển. Đây là một trong những giải pháp góp phần nâng cao hiệu quả công tác chẩn đoán xét nghiệm cũng như phòng chống các dịch bệnh này tại Việt Nam.

1. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào nội dung đánh giá hiệu quả của phương pháp multiplex Real-time RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi và virus gây bệnh dịch tả lợn cổ điển. Hiệu quả của phương pháp được đánh giá bằng các chỉ tiêu như: Hiệu suất của phản ứng, giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu phân tích (độ chọn lọc), độ nhạy, độ đặc hiệu chẩn đoán, độ lặp lại và tái lặp. Các thí nghiệm với phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR  được  thực hiện tại phòng thí nghiệm, thuộc Trạm Chẩn đoán  xét  nghiệm  bệnh  động  vật,  Chi  cục Thú y vùng IV.

2. Vật liệu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu virus ASF và CSF là các mẫu thực địa (được thu thập trong đợt dịch trước đây) đã được chẩn đoán là dương tính và âm tính bằng phương pháp sRealtime RT-PCR. Các mẫu (dạng đã tách chiết DNA/RNA)  hiện đang được lưu giữ tại Trạm chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật, Chi cục Thú y vùng IV. Bên cạnh đó các RNA của các virus như: Lở mồm long móng (FMDV), Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV), cúm lợn (SIV) thu thập được từ các mẫu đã xét nghiệm trước đây cũng được sử dụng để kiểm tra độ đặc hiệu của mReal-time RT-PCR. Đối chứng dương chuẩn là các plasmid tái tổ hợp có chứa trình tự của đoạn gene mục tiêu để phát hiện ASFV và CSFV (p-ASFV và p-CSFV có nồng độ là 1,25x1010 copies/µL mỗi loại) được cung cấp bởi công ty cổ phần công nghệ TBR (Bình Tân, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam).

3. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Phương pháp tách chiết RNA/DNA

Các mẫu từ các địa phương gửi đến để xét nghiệm bệnh ASF và CSF có thể là máu, gan, lách, hạch bẹn... Mẫu được xử lý thành huyễn dịch 10% với dung dịch  PhosphateBuffered Saline (PBS, pH = 7,4) vô trùng. Sau đó ly tâm 1000 g trong 5 phút, thu dịch nổi. Dịch nổi  sẽ được sử dụng để tách DNA/RNA bằng kit MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification (Thermo  Fisher Scientific, Mỹ) chạy trên  máy KingFisher™ Purification System (Thermo Fisher, Phần Lan), các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi  tách chiết DNA/RNA đã được bảo quản ở 4-8ºC.

3.2. Đoạn mồi, đầu dò, thành phần và chu kỳ nhiệt của mReal-time RT-PCR

Phản ứng mReal-time RT-PCR được thực hiện bằng cách sử dụng kít nhân gene Sensifast Probe No-Rox (Median, Anh), các bước thực hiện theo hướng dẫn nhà sản xuất. Thành phần phản ứng mReal-time RT-PCR gồm: Nước không có Dnase/Rnase 2,4 µL; 2X Buffer 10 µL; 0,  µL mỗi mồi đặc hiệu cho ASFV và CSFV (nồng độ 20 pmol/µL); 0,5 µL  đoạn  dò (nồng độ 6 pmol/µL); 0,4 µL Ribosafe Rnase Inhibitor; 0,2 µL Reverse transcriptase và 4 µL mẫu. Phản ứng mRealtaimRT-PCT được chạy trên máy Real-time PCR (CFX96  TouchReal-time System, Singapore) với chu kỳ nhiệt và thời gian.

3.3. Tối ưu hóa phương pháp mReal-time RT-PCR

Plasmids của ASFV và CSFV được pha loãng bậc 10 (chọn từ  nồng độ 1,25x109đến 1,25x 100 copies/µL) để xây dựng đường chuẩn và khảo sát giới hạn phát hiện của  phương  pháp. Trong nội dung này, phương pháp Real-time RT-PCR đơn mồi (sReal-time  RT-PCR) được  sử dụng như phương pháp tham chiếu. Độ ổn định của đường chuẩn được đánh giá qua (1) hệ số tương quan R2, đánh giá độ chính xác thao tác thực hiện  là phải đạt từ 0.975 hoặc 0,99; (2) Hiệu quả khuếch đại E, trong điều  kiện lý  tưởng  giá  trị  E = 100%, tuy nhiên trong thực tế thì giá trị E chấp nhận được ở mức 80-110 hoặc  90-105%. Giới hạn phát hiện được xác định tại nồng độ cuối cùng còn cho kết quả dương tính ở cả 3 lần lặp lại. Sau đó giá trị Ct ở cùng 1 nồng độ giữa hai phương pháp sReal-time RT-PCR và  mReal-time RT-PCR được so sánh.

Độ lặp lại và tái lặp của mReal-time RT-PCR được đánh giá bằng cách sử dụng 03 nồng độ (cao, trung bình, thấp) của hỗn hợp p-ASFV và p-CSFV tiến hành chạy lặp lại  3  lần của cùng 1 nồng độ trong cùng 1 lần chạy để đánh giá độ lặp lại và tiến hành chạy lặp lại 03 lần chạy khác nhau để đánh giá độ tái lặp.

Độ  đặc hiệu phân tích (hay mức độphản  ứng chéo với một số  virus tương đồng) của  phương pháp mReal-time RT-PCR được đánh giá bằng cách thực hiện trên mẫu DNA/RNA  của  các virus ASF (5 mẫu dương và 5 mẫu âm), CSF (5 mẫu dương và 5 mẫu âm); FMD (Foot and mouth Disease, 5 mẫu), PRRS (Porcine Reproductive andRespiratory  Syndrome, 5 mẫu), SIV (swine influenza virus, 5 mẫu).

Độ  nhạy  và  độ  đặc  hiệu  chẩn  đoán của  mReal-time  RT-PCR được đánh giá bằng cách sử dụng các mẫu DNA/RNA của virus ASF và CSF đã có kết quả xét nghiệm dương tính và âm tính bằng phương pháp sReal-time PCR và sReal-time RT- PCR.

Trong nghiên cứu này, 75 mẫu thực địa (10 mẫu dương tính với CSFV, 15 mẫu dương tính với ASFV và 50 mẫu âm tính với cả CSFV và ASFV bằng phương pháp sRealtime RT-PCR) đã được sử dụng để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán.Xét  nghiệm  mReal-time  RT-PCRtrên mẫu thực địa: Các mẫu máu, mẫu mô được gửi đến xét nghiệm tại Chi cục Thú y vùng IV. Các mẫu này được tách chiết và chạy nhân gene theo phương pháp sRealtime RT-PCR và phươngphápmRealtime RT-PCR.Trong quá trình tách chiết DNA/RNA thì sử dụng mẫu đối chứng dương đã biết trước giá trị Ct để kiểm tra quá trình tách chiết. Tương tự khi chạy phản ứng nhân gene cũng sử dụng mẫu đối chứng dương DNA/RNA đã biết trước giá trị Ct.

3.4. Phương pháp xử lý số liệu

Giới hạn phát hiện của phương pháp được đánh giá trên mẫu đối chứng dương được xác định qua giá trị Ct tại nồng độ pha loãng thấp nhất vẫn cho kết quả dương tính. Độ đặc hiệu được xác định qua xác định mức độ phản ứng chéo với một số virus khác FMD, PRRS, SIV.Cách  tính  độ  nhạy và độ đặc hiệu của mReal-time RT-PCR.

Độ nhạy của phương pháp được tính theo công thức:

SE = TP/(TP+FN) x 100

Độ đặc hiệu của phương pháp được tính theo công thức:

SP = TN/(TN+FP) x 100

Trong đó: TP (True Positive): Dương tính đúng (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính); FP (False Positive): Dương tính giả (Mẫu chứng  có kết quả âm tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính); FN (False Negative): Âm tính giả (Mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích cho kết quả âm tính); TN (True Negative): Âm tính đúng (Mẫu chứng có kết quả âm tính, kết quả phân tích cho kết quả âm tính).

4. Kết luận

Phương pháp mReal-time RT-PCR được đánh giá trong nghiên cứu này có hiệu suất phản  ứng mReal-time RT-PCR cho ASFV và CSFV là 96,8 % và 96,4%; giới hạn  phát  hiện  là  12,5 copies/μL đối với ASFV và CSFV. Phương pháp mReal-timeRT-PCR có độ nhạy chẩn đoán đối với xét nghiệm ASFV và CSFV là 100%. Độ đặc hiệu chẩn đoán của phương pháp với ASFV và CSFV là 98,0% và 100% theo thứ tự. Kết quả thi được từ phân tích các chỉ tiêu đánh giá và phân tích mẫu thực địa cho thấy phương pháp mReal-time RT-PCR  có đủ điều kiện để áp dụng xét nghiệm phát hiện đồng thời virus CSF và ASF.