Trong số các loại nấm men đỏ sản xuất caroteinoid thì Rhodosporidium sp. được đánh giá có ưu thế cao để có thể tổng hợp hiệu quả các phân tử này với hàm lượng cao và khả năng sinh trưởng nhanh. Ở hầu hết nấm men, con đường sinh tổng hợp carotenoid đều có  sự  biến đổi acetyl - CoA thành 3 - hydroxymethyl glutaryl - CoA (HMG-CoA) bởi HMG -CoA synthase. HMG – CoA sẽ chuyển đổi thành hợp chất C6, mevalonic acid (MVA), tiền chất đặc biệt đầu tiên của con đường sinh tổng hợp terpenoid. MVA trải qua một chuỗi các  phản ứng phosphoryl hóa bởi enzyme MVA kinase đồng thời bị decarboxyl hóa để tạo  thành isopentenyl pyrophosphate (IPP). IPP biến đổi đồng phân thành dimethylallyl  pyrophosphate (DMAPP) bằng cách gắn liên tiếp 3 phân tử IPP tạo thành DMAPP. Các phản ứng này được xúc tác bởi prenyl transferase tạo thành  hợp chất C20 geranyl  geranyl pyrophotphate  (GGPP). Sự trùng hợp 2 phân tử GGPP tạo ra phytoene (hợp chất C40 đầu tiên của quy trình). Cuối cùng là giai đoạn tổng hợp carotenoid từ phytoene, phytoene  được  chuyển  thành  lycopene. Lycopene được xem là tiền chất để  tổng hợp nên β-carotene và torulene, sau đó torulene sẽ tham gia quá trình khử và oxy hoá nhờ sự xúc tác của enzyme oxidase để hình thành nên torularhodin. Các yếu tố dinh dưỡng (nguồn carbon, nitơ, vitamin,…) và vật lý (nhiệt độ, pH, oxy, ánh  sáng,...) cũng ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào và biểu hiện gen carotenogenesis hay quá trình sinh tổng hợp sắc tố.

Nấm men có thể tổng hợp carotenoid khi được nuôi cấy trong môi trường thương mại, chứa nhiều nguồn carbon tinh chế khác nhau,  chẳng  hạn  như  glucose,  xylose, cellobiose, sucrose, glycerol và sorbitol, tuy nhiên loại môi trường này có chi phí cao. Một số loại chất  nền chi phí thấp hơn đã được nghiên cứu để sản xuất carotenoid bởi nấm men đỏ, chẳng hạn như nước mía, váng sữa, rỉ đường, rượu ngô. Chất thải từ trái cây là chất nền tiềm năng để sản xuất carotenoid vi sinh vật do chứa nhiều carbon và khoáng chất. Hơn nữa, vỏ trái cây cũng chứa các tiền chất carotenoid bao gồm geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) liên quan đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid theo con đường methyl - D - erythritol - 4 - phosphate (MEP).

Nhằm tìm kiếm môi trường thích hợp, tối ưu chi phí cũng như tận dụng nguồn chất thải hữu cơ có sẵn để sản xuất carotenoid, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hiệu quả của việc sử dụng dịch chiết từ vỏ dứa để tổng hợp carotenoid bằng loài  nấm  men R. paludigenum.  Đồng thời khảo sát ảnh hưởng một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid của loài  R. paludigenum được nuôi cấy trong môi trường có chứa dịch chiết từ vỏ dứa.

1. Vật liệu

Chủng nấm men R. paludigenum được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh thuộc Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.

Chất nền: Vỏ dứa được đun ở 100⁰C trong 30 phút theo tỉ lệ 1:1 (vỏ dứa : nước cất). Dịch chiết được lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ 100 µm và được sử dụng làm môi trường lên men.

2. Phương pháp

Phương pháp hoạt hóa và tăng sinh:

Nấm men R. paludigenum đã được giữ giống trong môi trường Hansen chứa 50% glycerol, bảo quản ở  -20⁰C. Hoạt hóa bằng cách  cấy ria trên môi trường Hansen và nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Từ các khuẩn lạc đơn thu được trên đĩa thạch, chọn một khuẩn lạc đơn cho vào nuôi cấy trong bình thủy tinh tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường Hansen. Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28⁰C, trong 24 giờ.

Tổng hợp carotenoid bằng nấm men R. paludigenum: Bổ sung 1 mL dịch nuôi cấy nấm men (106 tế bào/mL) vào các bình tam giác (thể tích 250 mL) có chứa 50 ml dịch chiết vỏ dứa theo 3 nghiệm thức khác nhau với pH = 6 và ủ ở 25⁰C, trong máy lắc ủ nhiệt với tốc độ lắc 120 vòng/phút trong 6 ngày. Thành phần của các nghiệm thức cụ thể như sau: nghiệm thức 1 (NT1) chỉ chứa dịch chiết vỏ dứa; nghiệm thức 2 (NT2) bao gồm dịch chiết vỏ dứa + 3 g/L KH₂PO₄, 3 g/L MgSO₄.7H₂O,10 g/L peptone; nghiệm thức 3 (NT3)  -  50 mL môi trường Hansen lỏng (50 g/L D-glucose + 3 g/L KH₂PO₄, 3 g/L MgSO₄.7H₂O,10 g/L peptone). Kết thúc thí nghiệm tiến hành đánh giá các chỉ tiêu: sinh  khối  khô  của  nấm  men,  hàm  lượng carotenoid, hàm lượng đường khử.

Ảnh hưởng của pH (4, 5, 6, 7), nhiệt độ (20⁰C, 25⁰C, 30⁰C, 35⁰C), thời gian ủ (5, 6, 7, 8  ngày) cũng đã được tiến hành với các chỉ tiêu đánh giá sinh khối khô nấm men, hàm lượng carotenoid.

Tách chiết và định lượng carotenoid:

Dịch  nuôi  cấy  lỏng  được  ly  tâm  4000 vòng/phút trong 5 phút để thu kết tủa. Phần dịch nổi phía trên được giữ lại để xác định nồng độ đường khử. Kết tủa được rửa 2 lần bằng nước cất và đem sấy ở 50⁰C đến khối lượng  không  đổi.  Carotenoid  được  tách chiết từ sinh khối khô bằng cách sử dụng Dimethyl  sulfoxide  (DMSO)  và  acetone. Bổ sung 0,2 g sinh khối vào 3 mL DMSO và ủ trong 1 giờ, voxtex trong 3 phút. Sau đó, bổ sung thêm 6 mL acetone, ly tâm ở 1800 vòng ở 25⁰C trong 10 phút. Thu dịch nổi (lặp lại 2-3 lần đến khi các tế bào mất màu). Thu và gộp tất cả dịch chiết acetone và dịch nổi chứa DMSO. Thêm 10 mL NaCl 20% (w/v) và 10 mL Petroleum ether  (PE).  Sau  khi  khuấy  và  tách  pha, lượng nước thừa được loại bỏ bằng Na₂SO₄ để thu được carotenoid. Thu dịch nổi sắc tố trong pha PE.

Tổng nồng độ carotenoid được xác định bằng phép đo quang phổ (Biospectro, SP 220, Trung Quốc) ở bước sóng 474 nm. Hàm  lượng  carotenoid  trên  1  g  sinh  khối nấm  men  khô  (mg/g) tính theo phương trình: C = 100𝐴𝑉/21𝑚.

Trong  đó:  C-  Hàm  lượng carotenoid (mg/g); A-  Độ hấp thụ của dịch chiết sắc tố trong dung môi PE ở bước sóng 474 nm (2100 mol/L/cm) (5); V- Thể tích dịch chiết sắc tố  (mL); m- Sinh khối khô nấm men dùng để chiết (g).

Hàm  lượng  sắc  tố  tính  trên  thể tích dịch  nuôi  cấy  nấm  men  (μg/L)  tính  theo công  thức:  T  =  C*m,  trong  đó,  T-  Hàm lượng carotenoid tính trên thể tích dịch nuôi cấy (mg/L); C- Hàm lượng carotenoid tính trên gam sinh khối khô (mg/g); m- Sinh khối khô tính trên 1 lít dịch nuôi cấy (g/L).

Khảo  sát  hoạt  tính  chống  oxy  hoá:

Hoạt động loại bỏ gốc tự do được xác định bằng  phương  pháp  khử  màu  ABTS⁺ (2,2'-azino-bis  (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic  acid))  được  mô  tả  bởi  Re  và  cs.  Dung  dịch  ABTS⁺ được chuẩn bị bằng cách cho 10 mL dung dịch ABTS 7 mM và 10 mL dung dịch K₂S₂O₈ 2,45 mM.

Ủ dung dịch trong tối 16 giờ, sau đó pha loãng bằng ethanol, điều chỉnh độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm có mật độ quang là 0,7±0,05. Tiến hành khảo sát hoạt động trung hòa gốc tự do ABTS⁺ bằng cách cho 10  μL dịch  chiết  carotenoid  vào 990 μL ABTS⁺. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 6 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 734 nm. Kết quả so sánh với Vitamin C. Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức: [100*(A-B)]/A, trong  đó: A- giá trị OD₇₃₄  của  mẫu  đối chứng (thay mẫu bằng dung dịch đệm); Bgiá trị OD₇₃₄ của mẫu.

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: Các chủng vi sinh vật kiểm  định:  Escherichia coli  (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC  15442),  Samonella typhirinum 13.100816 cung cấp bởi khoa Y - Dược, Đại học Đà Nẵng.

Hoạt tính kháng khuẩn được khảo sát bằng phương pháp đục lỗ thạch. Carotenoid được hòa tan trong DMSO. Đối chứng âm được sử dụng là DMSO, đối chứng dương là chất kháng sinh tetracyclin. Hút 100 μLchất thử nghiệm cho vào lỗ thạch và ủ các đĩa petri trong 24 giờ ở 37⁰C. Quan sát kết quả dựa vào vòng vô khuẩn.

Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu: Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Các số liệu được xử lý và xác định ý nghĩa thống kê bằng phần mềm xử lý số liệu SPSS 22.0.

3. Kết luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ vỏ dứa có thể được sử dụng như chất nền để tăng cường khả năng tổng hợp carotenoid từ nấm men R. paludigenum.Điều  kiện  nuôi  cấy  tối  ưu  để  tổng  hợp carotenoid là 225°C, sau 6 ngày ở pH môi trường là 6,0. Hàm lượng carotenoid đạt giá trị cao nhất là 1,332±0,006 mg/g và 6,362±0,539 mg/L. Dịch chiết thu được từ R. paludigenum có hoạt tính kháng oxy khá mạnh đạt 93,52±0,32% và đồng thời cókhảnăng kháng vi khuẩn Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas  aeruginosa(ATCC 15442), Samonella typhirinum13.100816. Kết quả của nghiên cứu là cơ sở khoa học cho việc sử dụng vỏ dứa để sản xuất carotenoide, giúp giảm chi phí sản xuất hợp chất này, cũng như tận dụng phụ phẩm nông nghiệp và bảo vệ môi trường.