Ngoài ra, V. harveyi đã được xác định là tác nhân cơ hội trên nhiều đối tượng khác, chúng có khả năng sản sinh nhiều yếu tố độc lực liên quan đến khả năng gây bệnh, bao gồm: (i) có khả năng di động và bám dính, (ii) sản sinh các polysaccharides ngoại bào và hình thành màng sinh học biofilm; (iii) sản sinh nhiều enzyme thủy phân; (iv) khả năng thu thập và tích lũy sắt; (v) khả năng cảm nhận và nhận biết vật chủ; và (vi) tạo thành thể thực khuẩn.

Các vi sinh vật có khả năng cảm nhận và phát hiện các chất hóa học được tiết ra từ vật chủ như hormone. Khả năng nhận biết này giúp vi sinh vật có thể phát hiện các ký chủ tiềm năng và sau đó gia tăng sự biểu hiện gen của cá thể nhằm tăng độc lực và xâm nhập vào vật chủ. Nhiều nghiên cứu tập trung vào mối liên hệ giữa vi khuẩn và các loại hormone, đặc biệt là các hormone phản ánh tình trạng căng thẳng của vật chủ (stress hormone - được tiết ra khi vật chủ bị stress), bao gồm epinephrine, norepinephrine và dopamine.

Sự gia tăng hàm lượng stress hormone đã được chứng minh làm giảm chức năng miễn dịch tế bào của vật chủ, đồng thời làm tăng mật độ phát triển và độc lực của vi khuẩn. Mối tương quan dương giữa hàm lượng stress hormone là catecholamine với các yếu tố độc lực như sản sinh các enzyme ngoại bào, độc tố, các phần tử kết dính cũng như màng sinh học (biofilm) và quorum sensing ở nhiều vi khuẩn Gram (-). Khả năng phản ứng của vi khuẩn với sự tồn tại của các stress hormone được báo cáo ở nhiều vi khuẩn, bao gồm: Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi và Yersinia ruckeri. Sự biến động lớn của các yếu tố môi trường như độ mặn, NH₃, NO₂ sẽ làm tăng nồng độ các axit amin sinh học (biogenic amines) như norepinephrine và dopamine trong máu, làm giảm đáp ứng miễn dịch, và tăng khả năng nhiễm bệnh trên động vật thuỷ sản. Norepinephrine và dopamine được xem là các loại hormone (crustacean hypergly caemic hormone - CHH) làm tăng hàm lượng glucose trong máu tôm sú. Khi norepinephrine được tạo ra khi tôm thẻ chân trắng bị stress thì các chỉ tiêu miễn dịch như tổng số tế bào máu, khả năng thực bào, hoạt động sản sinh enzyme phenoloxidase, lysozyme đều giảm Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn V. harveyi, tuy nhiên việc nâng cao hiểu biết về độc lực của vi khuẩn này trong môi trường có mặt stress hormone vẫn còn nhiều hạn chế.

Sự hiện diện của hormone norepinephrine và dopamine có khả năng làm tăng tốc độ phát triển và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn V. harveyi. Tuy vậy, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của stress hormone epinephrine lên độc lực của vi khuẩn V. harveyi trên tôm thẻ chân trắng. Do đó nghiên cứu này thực hiện với mục tiêu nâng cao hiểu biết về độc lực của vi khuẩn V. harveyi dưới sự ảnh hưởng của epinephrine.

1. Nội dung nghiên cứu

1.1. Ảnh hưởng của các nồng độ epinephrine khác nhau lên hoạt tính một số enzyme do V. harveyi sản sinh (lipase, phospholipase, caseinase, haemolysin và chitinase)

1.2. Ảnh hưởng của hormone epinephrine lên khả năng di động của vi khuẩn V. harveyi

1.3. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm vi khuẩn V. harveyi trong môi trường có hoặc không bổ sung epinephrine

2. Vật liệu nghiên cứu

2.1. Vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy

Vi khuẩn V. harveyi phân lập từ mẫu tôm bị bệnh phát sáng tại tỉnh Thừa Thiên Huế được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm của nghiên cứu này. Vi khuẩn được giữ giống trong môi trường thạch lỏng Tryptic soy broth (TSB) (Sigma- Aldrich) bổ sung 2% muối NaCl (TSB+2%NaCl) có bổ sung glycerol 20% và bảo quản ở -80℃.

Trong mỗi thí nghiệm, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường TSB+2%NaCl với máy lắc vận tốc 100 rpm trong 24 giờ ở nhiệt độ 28℃. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy đo quang phổ ở bước song 600 nm.

2.2. Hormone epinephrine

Epinephrine (Sigma-Aldrich) được pha trong dung dịch axit hydrocholoride (HCl 0,1N) để tạo dung dịch gốc 10 mM. Dung dịch này được lọc qua giấy lọc (0,2 μm) và bảo quản ở -20℃.

3. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ epinephrine khác nhau lên hoạt tính một số enzyme do V. harveyi sản sinh (lipase, phospholipase, caseinase, haemolysin và chitinase)

Ảnh hưởng của hormone epinephrine lên hoạt tính enzyme của V. harveyi được thực hiện theo hướng dẫn của Yang và cs. với một số thay đổi nhỏ.

Môi trường Tryptic soy agar (TSA) (Sigma- Aldrich) có bổ sung 2% muối (TSA+2%NaCl) đã được hấp tiệt trùng (121℃, 15 phút tại 15 psi) và để nguội tới 55℃, sau đó được trộn với các cơ chất và epinephrine với các nồng độ khác nhau (0 μM - đối chứng, 25 μM, 50μM, 100 μM và 200 μM). Hoạt tính thủy phân của enzyme lipase được thực hiện bằng cách nhỏ 5μL huyền phù vi khuẩn (OD600 =0,5) trên đĩa thạch có chứa epinephrine và 1% Tween 80 (Sigma – Aldrich). Tất cả đĩa thạch được ủ tại 28℃ trong 48h, sau đó tỷ lệ giữa đường kính vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc được đo và ghi lại.

Hoạt tính của enzyme phospholipase, caseinase, haemolysin và chitinase được thực hiện tương tự, bằng cách bổ sung cơ chất vào môi trường là 1% nhũ tương long đỏ trứng (Sigma-Aldrich) để xác định hoạt tính phospholipase, hoặc 4% bột sữa tách béo (Woolworths, Úc) cho việc xác định hoạt tính phospholipase, hoặc 5% máu cừu cho hoạt tính haemolysin hoặc 0,1% bột colloidal chitin (Himedia, Ấn Độ) để thử hoạt tính chitinase. Thí nghiệm được bố trí với 6 lần lặp lại cho mỗi hoạt tính và nồng độ nghiên cứu.

3.2. Ảnh hưởng của hormone epinephrine lên khả năng di động của vi khuẩn V. harveyi

Khả năng di động của vi khuẩn được thực hiện theo hướng dẫn của Yang và cs. Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường thạch mềm TSB+2% NaCl (chứa 0,3% agar) có bổ sung epinephrine với các nồng độ (0 μM - đối chứng, 25 μM, 50 μM, 100 μM và 200  M). 5μL dung dịch huyền phù vi khuẩn (OD600 =0,5) được nhỏ trên bề mặt thạch mềm và ủ tại nhiệt độ 28℃. Đường kính vòng di động xung quanh khuẩn lạc được đo sau khi ủ 24h. Tất cả các nồng độ được thực hiện lặp lại ít nhất 6 lần.

3.3. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm vi khuẩn V. harveyi trong môi trường có bổ sung hoặc không bổ sung epinephrine

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trong bể nhựa (80L) đã được khử trùng. Sau đó cấp nước mặn 20 ‰ vào khoảng 2/3 thể tích và sục khí liên tục. Tôm thí nghiệm: Tôm thẻ chân trắng có trọng lượng 2-2,5 g/con, kích cỡ đồng đều, màu sắc tươi sáng, được kiểm dịch không mang mầm bệnh Vibrio parahaemolyticus (hoại tử gan tụy cấp), Whispovirus (bệnh đốm trắng), và Okavirus (bệnh đầu vàng) tại Trạm xá Thú y, Chi cục Chăn nuôi và Thú y Thừa Thiên Huế. Mật độ nuôi 20 con/bể. Trước khi tiến hành thí nghiệm, 10 con tôm được chọn ngẫu nhiên để kiểm tra vi khuẩn bằng cách lấy mẫu gan tụy cấy trực tiếp trên môi trường TSA+2%NaCl và môi trường TCBS.

Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh 24 giờ ở 28⁰C trong môi trường thạch lỏng TSB+2%NaCl, có hoặc không bổ sung epinephrine. Nồng độ epinephrine sử dụng trong thí nghiệm này được xác định dựa vào kết quả thử độc lực của vi khuẩn trong thí nghiệm ở nội dung 1 và 2 (50 μM). Sau 24h nuôi cấy, dung dịch huyền phù vi khuẩn được ly tâm và rửa 2 lần bằng dung dịch NaCl 0,85%. Mật độ vi khuẩn trong thí nghiệm cảm nhiễm được xác định dựa vào liều lượng gây chết 60% - LD60 là 106 CFU/mL (đã được xác định, số liệu không công bố). Tôm được cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm trong môi trường nước có chứa vi khuẩn (vi khuẩn được nuôi trong môi trường có bổ sung hoặc không bổ sung epinephrine) và nghiệm thức đối chứng (không bổ sung vi khuẩn) trong 15 phút. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức. Tôm sau khi cảm nhiễm được nuôi trong hệ thống nước chảy tốc độ 14 L/phút, nhiệt độ 28-30⁰C. Tôm được cho ăn 2 lần/ngày (vào lúc 8h và 16h) với khối lượng tương đương 2% trọng lượng thân bằng thức ăn CP. (Việt Nam) và chế độ sục khí liên tục 24 giờ/ngày (DO ≥5 mg/L). Chế độ xi phông và thay nước (25%) được thực hiện hàng ngày. Tỷ lệ chết (TLC) được theo dõi và xác định trong 14 ngày. Tỷ lệ chết được xác định bằng công thức sau: TLC  (số tôm chết) x100/tổng số tôm thí nghiệm.

3.4. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thu thập và so sánh bằng phần mềm SPSS phiên bản (IBM SPSS 23.0). Phân bố chuẩn và sự đồng nhất phương sai được xem xét bằng test Shapiro- Wilk và Levenes test trước khi so sánh ANOVA. Tất cả số liệu được so sánh giá trị trung bình bằng ANOVA với phép thử Tukey post hoc test hoặc So sánh nhiều cặp - Multiple comparisons of Dunnett T3 (giả định phương sai không đồng nhất) với mức ý nghĩa p < 0,05. Phân tích tỷ lệ sống Kaplan-Meier (Survival analysis) và tất cả đồ thị được xử lý và vẽ bằng phần mềm GraphPad Prism 9.0.

4. Kết luận

Trong điều kiện môi trường có bổ sung epinephrine với các nồng độ (50μM, 100μM và 200 μM) làm tăng khả năng di động, tăng hoạt tính enzyme lipase, phospholipase, haemolysin và caseinase nhưng không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme chitinase. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng trong thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V. harveyi trong điều kiện có mặt của epinephrine 50 μM thấp hơn so với đối chứng.